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【云飞杂记】细菌传之重组
2022-09-15 16:16:12.0 来源:新2网址 作者云飞

专利制度是给天才之火浇上利益之油。——林肯

1978年,也就是在乌斯提出“古细菌”概念一年后,基因泰克通过大肠杆菌制造重组人胰岛素获得成功。

健客之前讲过胰岛素。

云飞嗯,接下来咱们分两期聊聊重组DNA的故事。

1968年冬天,42岁的伯格结束了11个月的长假回到斯坦福大学。伯格是一名生物化学家,前半生专注于蛋白质合成研究,但他开始重新思考今后的研究方向。在此期间,伯格与年长12岁的索尔克生物研究所的创始人之一,病毒学家杜尔贝科一同进行动物病毒研究,他花了很长时间思考基因和病毒,思考遗传信息是如何传递的。研究环境、研究项目、研究伙伴的重新组合,让伯格找到了新方向,焕发了新热情。

健客之前聊到很多有名的生物学研究机构,如巴斯德研究院、科赫研究所、冷泉港实验室,还有很多大学实验室,但是没听说索尔克生物研究所,很有名吗?

云飞索尔克生物研究所是美国加州南部拉霍亚的一个独立非营利科学研究机构,是美国生命科学领域成果最多、质量最高的研究机构之一。2004年,时代高等教育增刊对全世界的生物医学研究机构进行排名,索尔克生物研究所位列第一。

伯格对猴病毒40情有独钟。它有7个基因,与很多宿主细胞和平相处。有些病毒在感染宿主细胞之后可以复制自身产生数百万计的新病毒,并最终导致宿主细胞的死亡,如天花病毒,而猴病毒40可以将自身DNA插入宿主细胞的基因组,如果不存在特定的激活信号,这些插入宿主细胞基因组的基因会一直处于休眠状态。伯格认为猴病毒40是传递遗传信息的理想载体,他觉得如果能够将外源性基因载入猴病毒40基因组,那么这个外源性基因将有可能随着病毒基因组一同被插入到人细胞的基因组之中,从而修改宿主细胞的遗传信息。伯格明白实现这一目标并非易事,他面对的第一个技术障碍便是如何将外源基因插入病毒的基因组,也就是说他必须找到能够人工构建病毒基因与外源基因嵌合体的方法。与人类细胞内DNA的线性结构不同,猴病毒40的DNA为环状结构。病毒在入侵进入宿主细胞之后,环状的DNA会打开形成线性结构,在环状DNA被打开之后才能将病毒DNA插入到宿主细胞基因组之中。伯格认为,如果要向猴病毒40的DNA中插入外源基因,也需要先打开猴病毒40的环状DNA,再将DNA片段连接到一起重新形成环状DNA。接下来的工作则交给病毒自己来完成,病毒将携带外源基因感染宿主细胞,并将该外源DNA片段插入到宿主细胞的基因组中。

1969年,同样是在斯坦福大学,另一课题组的研究生曾写过一个研究计划细胞中的基因与建筑中使用的钢梁并没有什么差别,同样可以被改造以适应人的各种需求,但最重要的是如何找到改造基因的工具。

健客是不是有点像电脑文字编辑啊?

云飞嗯,都是编辑,一个编辑的是文字,一个编辑的是基因,而且文字和基因传递的都是信息。只不过不同的电脑命令对应不同的酶罢了。

从20世纪60年代开始,科研人员就已经开始尝试从细菌中纯化出能够在体外对游离DNA进行连接的酶。理论上来讲,任何细胞内都应该存在这种类型的酶,细胞复制过程以及DNA损伤的修复过程都需要这种酶的参与。但是DNA剪切酶却不太容易找到。一般而言,细胞不需要剪切酶来剪切DNA。细菌进化出一套能够剪切入侵病毒DNA的酶,作为自身防御的武器,抵抗病毒的入侵,这种酶被称为限制性内切酶。虽然将外源性基因载入猴病毒40基因组涉及的实验操作以及各种试剂均是舶来品,但是这项技术的创新之处在于重新组合,将不同的DNA剪开并连起来。

健客“限制性”是什么意思?

云飞限制性是指他们能够识别DNA的特定序列,只在特定位点剪切DNA。这种限制性至关重要,如果胡剪一通,就会损伤自身DNA,影响细胞分裂,导致生命终结。

1970年冬天,伯格等人开始第一次尝试剪切和连接两个DNA片段。他们当时的实验过程非常繁琐,伯格曾把这个实验形容成生物化学家的噩梦。他们首先需要纯化DNA,将DNA与酶混合,之后进行低温柱层析纯化,而且他们需要不断地重复以上操作以优化生化反应条件。尽管存在技术上的种种限制,伯格等人最终还是成功将猴病毒40的整个基因组与λ噬菌体的一个DNA片段以及大肠杆菌的三个基因进行了连接。猴病毒40和λ噬菌体都是病毒,但它们之间存在着巨大的差异,大肠杆菌与猴病毒40相比则是完全不同的生物。伯格等人成功地将这些来源于不同生物的遗传物质重新组合到了一起。伯格将这个杂合的DNA称为重组DNA,就是重新组合DNA,重新组合遗传物质。

在这之后,伯格的实验室来了一名新的研究生默茨。原先的实验操作是将大肠杆菌的遗传物质插入到猴病毒40的基因组中。默茨想“如果将猴病毒40的基因片段插入大肠杆菌的基因组中呢?”事实证明,这个奇思妙想产生了巨大的技术优势。大肠杆菌携带一种被称为质粒的小型DNA,与猴病毒40基因组相同,质粒的结构同样为环状,能够在细菌内复制。如果将猴病毒40的基因插入到大肠杆菌的质粒中,那么有可能将大肠杆菌转变为外源基因复制的工厂。随着大肠杆菌的增殖,大肠杆菌胞内的质粒也会随之扩增,从而产生大量的外源基因克隆。

1972年6月,默茨离开斯坦福前往纽约的冷泉港参加动物细胞和病毒培训课程,这项课程要求学生针对自己未来的研究计划做简单报告。在报告中默茨解释了她的研究计划构建猴病毒40和大肠杆菌DNA的杂合体,并使其能够随着大肠杆菌的增殖不断扩增。研究生的研究课题一般不会引起专家们的兴趣,但当默茨结束报告的时候,大家开始意识到这不是一场简单的学术报告,先是一段长时间的沉默,紧接着问题如潮水般涌来你有没有想过构建DNA杂合体的风险?这样做会不会对人类产生危害?有没有考虑过该项技术带来的伦理问题?有人给伯格打电话,讨论重组DNA的技术风险。实验确实存在风险因素猴病毒40能够诱导仓鼠细胞突变形成肿瘤。虽然没有可靠证据表明猴病毒40可能诱发人类细胞癌变,但在20世纪70年代,尚不清楚该病毒的风险。由于大肠杆菌能够在人类的肠道生存,如果默茨和伯格真的成功构建了携带猴病毒40外源基因的大肠杆菌杂合DNA,如果猴病毒40真的诱发人细胞癌变,那么这种携带重组DNA的大肠杆菌是不是真的会诱发人细胞癌变,引发一场灾难呢?尽管伯格相信猴病毒40的安全性并不存在问题,他也不得不小心应对外界的质疑。

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伯格决定采取折中的办法,只对游离DNA进行操作,不将杂合DNA引入活细胞之中,以此避免诱导细胞癌变的风险。而此时的默茨却给了伯格一个很大的惊喜,她的实验迎来了一个重大突破。此前伯格等人剪切和连接DNA需要6步操作,极为繁琐。但默茨发现了一条捷径,能够将剪切和连接DNA的步骤减少为两步,从而使该实验变得异常高效。她用的限制性内切酶是加州大学旧金山分校的微生物学家伯耶提供的。伯耶比伯格小10岁。1966年,伯耶以助理教授身份加入加州大学旧金山分校,此后便一直专注于纯化限制性内切酶。

1972年11月,伯格还在艰难权衡病毒、细菌杂合体的风险,此时的伯耶已前往夏威夷参加当年的微生物学会议,并遇见了斯坦福大学的科恩。伯耶和科恩都知道伯格的重组DNA研究。科恩已经成功分离出一些大肠杆菌质粒,而且他已经能够非常高效地纯化其中某些类型的质粒,能够方便地使质粒在大肠杆菌种系之间转移,而且他发现其中的一些质粒携带某些抗性基因,例如四环素和青霉素的抗性基因。

健客好像之前讲过基因转移吧?

云飞嗯,转化和共轭(接合)都是细菌水平基因转移的方式,其中共轭就是以性菌毛为桥,以质粒为媒,雄性菌向雌性菌转移遗传物质。

如果将抗性基因从质粒中剪切下来,转移到另一质粒上会怎样呢?是不是能够使大肠杆菌获得抵抗抗生素的能力,从而能够在抗生素的环境中存活,而不携带该质粒的大肠杆菌则被抗生素杀死?两人意识到了这一想法的科研价值,因为在伯格等人的实验过程中并没有找到合适的办法鉴别哪些细菌或者病毒是否获得外源性的DNA。而科恩的那些携带抗生素抗性的质粒却能够高效的鉴别重组DNA,因为只有获得具有抗生素抗性基因的外源DNA,大肠杆菌才能够在具有抗生素的环境中生存,以此验证是否成功构建了重组DNA。

之后是漫长的沉默,但他们的思绪一刻都没有停歇。科恩首先打破沉默,小声说“也就是说……”还没等他说完,伯耶便说“对,这应该是可行的。”科恩和伯耶的实验还有一个非常重要的优势是伦理风险更小。伯格和默茨的实验是病毒、细菌杂合,科恩和伯耶的实验只包含细菌的基因,因此科恩和伯耶认为至少理论上来讲他们的实验生物危害性更小。

1972年冬天以及1973年春天,伯耶和科恩一直在忙碌地进行构造DNA杂合体的实验。此时的伯格和默茨虽然已经知道同一学校的科恩在进行重组DNA研究,但他们仍然没有进行将重组DNA导入大肠杆菌的实验。

1973年2月,伯耶和科恩已经开始将重组DNA导入活细胞。他们使用限制性内切酶对两种大肠杆菌质粒进行剪切,并将特定遗传信息从一种质粒转移到另一质粒上,之后使用连接酶将DNA片段完全连接形成嵌合体。该嵌合体在导入细菌细胞之后对细菌进行培养,外源基因会随着细菌的增殖不断被复制。他们的实验成功了,一项足以改变世界的新技术就此诞生。

一开始的时候,重组DNA技术只局限于学术机构的实验室,只有生物化学家才关注这项技术,但是不久之后便引起了媒体的关注。1974年5月,《旧金山纪事报》对科恩进行了专访,并且在文章中重点介绍了重组DNA技术的价值。文章说基因工程细菌未来将可能成为生物工厂,用来生产药物和小分子化合物。很快《纽约时报》等媒体开始跟进报道。斯坦福大学专利事务办公室的赖默斯从报纸上读到了科恩和伯耶的实验后立即被这项研究的巨大潜力吸引。赖默斯主动找到科恩和伯耶,让他们联合申请技术专利,斯坦福大学和加州大学旧金山分校也持有专利权。科恩和伯耶对赖默斯的举动感到很惊讶,因为他们从来没想过重组DNA技术能够申请专利,也没有想到这项技术可能具有极大的商业价值。

1974年冬天,虽然科恩和伯耶仍然很怀疑重组DNA技术申请专利的可能性,但还是在赖默斯的帮助下提交了专利申请书。两人申请专利的消息不胫而走。伯格对此感到非常气愤,觉得科恩和伯耶专利中的权利要求太荒唐,因为该专利的权利要求中声明他们拥有使用这项技术克隆DNA的商业所有权。伯格认为他们申请专利的行为简直可笑,这项由公共经费支持而诞生的技术,怎么可以通过专利申请使利益私有化? 

健客之前提到过白喉抗毒素和青霉素专利,名声好像都不太好啊!

云飞斯坦福大学被誉为西岸的哈佛,所不同的是,虽然斯坦福大学非常强调大学公共服务的理想,但是信奉在科学和商业之间存在跨界与交融的可能性。这种可能性,让赖默斯迈出跨界的第一步,打破官僚和教授文化僵硬的一面。

赖默斯的提案很简单专利申请办公室帮助大学的研究者申请专利,收取15%的专利使用费作为工作经费,其余三分之一收益作为奖励给发明者,三分之二由发明者的院系和大学平分,作为未来的科研经费。科学的公共性与商业的逐利性其实很难平衡。比如,一些开拓性的科学研究奠基在前人的研究之上,同时也获得国家经费的支持,如果申请了排他性的专利,就会被科学家嘲笑自私、逐利。大部分科学家都不希望因为一些专利使用费而被同仁的口水淹死。此外,考虑商业利益是不是有违大学提供公共服务的理想?这都是赖默斯面临的挑战。赖默斯知道要推动专利申请,首先要得到教授的支持。赖默斯耐心地说服两位发明人申请专利的好处,虽然两人最终被说服,但是都选择不接受专利使用费,而是将这笔钱捐献给大学。接下来,赖默斯说服加州大学的同事,以斯坦福承担所有专利申请费用,而加大可以对半分享收益,换取加大的支持……最终,他为重组DNA技术申请到了专利,创造了2.55亿美元的许可收入和专利费,为斯坦福大学专利办公室挣了差不多4000万美元的费用。1980年,美国国会通过贝赫-多尔法案,把赖默斯的“摸着石头过河”固化为法律。在日新月异的硅谷,赖默斯看到了太多创新公司上市之后的造富神话。他坚信公司是将学术界的想法转移到更广泛的公众身上的最佳载体。在风险投资日益兴起之后,他再次推动大学接受股权,而不仅仅是现金,作为专利使用费,为大学创收开辟了新的道路。在赖默斯的推动下,斯坦福重新定义与硅谷的关系,教授创业、学校持股,变得司空见惯。《纽约客》杂志给斯坦福起了一个外号,叫发财大学。其实,这也是一种重组,科学和商业的重组。

林肯是历史上第一位也是迄今为止唯一一位手握专利的美国总统。他持有编号6469的专利是一种抬升搁浅船只的装置。林肯年少时,他的一艘船因为不幸触底、倾斜,造成船舱进水,林肯不得不卸下船上所有的货物。当林肯成为国会议员时,他发现船只依旧经常遭遇这样的状况。针对此类情况,他开始加以专研。这项专利由坚固的框架和充满了空气的橡胶袋组成。在林肯的构想中,船长可以通过使这些橡胶袋膨胀或者缩小来改变船的浮力,这样即使装上很多货物都不用担心搁浅。这项发明于1849年获得专利,那一年,林肯40岁,离他当总统还有11年。“给天才之火浇上利益之油”,是林肯1858年对专利制度的生动评价。

在美国历史上,开国三杰华盛顿、杰斐逊、富兰克林共同参与了建国大业,同时也是美国专利制度的奠基人。尽管赢得了反抗英国殖民统治的战争而获得独立,美国实力仍大大落后于英国,前途依然充满凶险。美国虽然地大物博,但是科技和工业非常落后,与英国完全不可同日而语。英国掌握着当时最先进的科技,工业发展也最为成熟。英国努力发展科技和工业的同时,严禁技术出口。美国在赢得独立之前,作为英国海外殖民地时就得不到英国严格管制的技术,独立之后更被英国防范。如何促进科技发展、尽快掌握先进技术、加速建设先进工业成为亟待解决的现实问题。1787年颁布的美国宪法规定为发展科学和实用技术,国会有权保障作者和发明人在有限的时间内对其作品和发明享有独占权。在美国立国之初、百废待兴之时,专利制度作为头等要务来办。1790年,华盛顿就任美国历史上首任总统的次年,委派杰斐逊负责制定专利法,建立专利制度。杰斐逊当年便完成了这一任务。美国甚至比法国还早一年颁布专利法。杰斐逊后来成为了美国历史上第三位总统。杰斐逊除了是一名杰出的政治家,也是一名建筑师和发明家,清楚此中利害。政治家富兰克林同时是一名杰出的物理学家和发明家。他最早提出了电荷守恒定律,并且是避雷针的发明者。他也是美国专利制度建立的积极推动者。值得一提的是,富兰克林对科技造福社会持有非常开放的心态,乐于见到他的发明成果在美国、欧洲得到广泛、成功的商业应用,而没有通过申请专利去谋利。美国专利制度对打破英国技术封锁,推动技术引进、技术进步,效果非常显著。

结合时局,在国内外的商业活动中,专利、知识产权的话语权越来越强将是长期、必然趋势。邓小平提出“科学技术是第一生产力”。如何解放第一生产力?深化科技体制改革,增强科技创新活力势在必行。对科研机构、科研人员和科研成果的制度性安排,既要雪中送炭,也需要火上浇油。从按劳分配到按生产要素分配……重组无处不在。

欲知后事如何,且听下回分解。

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